В настоящее время в диагностике широко применяется иммуноферментный анализ (ИФА), в том числе в Службе крови. ИФА- скрининг донорской крови на маркеры ВИЧ, вирусных гепатитов В и С является обязательным во всем мире, а в странах Западной Европы, США, Канаде, Японии, Австралии, Новой Зеландии, Сингапуре и Гонконге плазму и кровь доноров, находящихся в периоде иммунологического окна, дополнительно подвергают NAT- скринингу (nucleic acid amplification technologies - генамплификафционная технология нуклеиновых кислот) с целью выбраковки. Международный опыт NAT-скрининга донорской крови свидетельствует о том, что после его применения в масштабах всей страны остаточный риск вирусных инфекций после трансфузий значительно снизился.

Создание международных NAT-стандартов позволило применить для NAT-скрининга крови различные методы, приборы и тест-системы, в том числе и "in-house" (разработанные в своей лаборатории). С началом производства международных NAT- стандартов во всем мире снята зависимость NAT-диагностики от дорогостоящих коммерческих тест-систем, так как можно объективно гарантировать чувствительность обнаружения любого патогена в данной лаборатории и в данное время при использовании любых приборов и тест-систем, в частности произведённых "in-house".

ПЦР - это один из ведущих методов молекулярной диагностики, который наряду с ИФА, биохимическими, цитологическими, культуральными и различными физико-химическими методами должен быть представлен во всех крупных клинико-диагностических лабораториях. В ИФА-лаборатории без особых усилий может разместить комплект небольших NAT-диагностических приборов. Генамплификационные (NAT) методы диагностики совместимы с другими диагностическими исследованиями, например, с ИФА, биохимическими, цитологическими, бактериологическими и т.д., если для исследования используется тот же материал.

В подавляющем большинстве случаев мини-пулы для NAT-скринирования донорской крови создают в формате 96-луночного микропланшета, используя автоматические самплеры Tecan, Hamilton и другие. Из аликвот сыворотки или плазмы по 100 мкл формируют мини-пулы из 8 (по вертикали планшета) и из 12 (по горизонтали планшета) донаций. Из пулов по 8 или 12 донаций создают пулы из 48 или 96 донаций. При отсутствии автоматического самплера эти операции можно производить вручную, используя автоматические пипетки с отдельными для каждой донации одноразовыми наконечниками.

Перед стадией экстракции РНК и ДНК из полученных пулов (особенно из пулов по 48 и 96 донаций) для снятия эффекта разбавления донации, содержащей вирус, эти пулы необходимо центрифугировать при 48 000 g 1 час. При этом вирусы концентрируются в образующемся плотном осадке на дне пробирки. Если такой возможности нет, следует использовать пулы из 8 или 12 донаций.

Для экстракции нуклеиновых кислот предпочтительно применять однопробирочный метод, одновременно экстрагируя РНК и ДНК и используя лизис с последующим осаждением. К полученному сухому осадку следует немедленно добавить реагенты для обратной транскрипции с последующей инкубацией 20 минут при 420С для перевода быстроразрушающейся вирусной РНК в кДНК. Полученный раствор подвергают ПЦР-анализу на все три вируса в соответствии с инструкцией к набору.

На основе большого опыта мы рекомендуем использовать двухрастворную компоновку реагентов для ПЦР-анализа, которая состоит из раствора для ПЦР, содержащего трифосфаты, внутренний стандарт, праймеры, и раствора Taq-полимеразы в двукратном буфере для ПЦР. ПЦР-амплификацию проводят в программируемом температурном режиме с обязательным включением 1-2 негативных контролей, не содержащих ДНК и кДНК, и положительных контролей (международных, национальных или лабораторных) в двух-трех разведениях в соответствии с инструкцией к набору.

Детекция продуктов ПЦР проводится методом гель-электрофореза, позволяющим раздельно обнаруживать сигналы вирусов и внутреннего стандарта. При наличии соответствующей аппаратуры и реагентов возможна флюоресцентная детекция продуктов ПЦР в закрытой пробирке, исключающей ложноположительные результаты, обусловленные продуктами ПЦР.

Внедрение NAT- тестирования донорской крови - веление времени. С той или иной частотой, в разных странах выявляют доноров с виремией, но без серологических признаков гемотрансмиссивной инфекции. Частота встречаемости NAT-позитивных ИФА-негативных доноров в центре крови Сакраменто (США) составляет для вируса гепатита С составляет 1:169 500, для ВИЧ - 1:566 328 (P.V. Holland, S. Aceituno, 2003). Во Франции этот показатель для вируса гепатита С равен 1:3 187 562, для ВИЧ - 1:1 594 000 (A. Assal et al., 2003). В Германии для вируса гепатита С - 1:1 411 183, для ВИЧ - 1:5 455 831, для вируса гепатита В - 1:430 854 (E. Seifried, W.K. Roth, 2003).

Следует отметить, что распространенность маркеров инфекций среди потенциальных доноров в развитых и развивающихся странах отличается в 10 - 1000 раз (J.-P. Allain et al., 2003). В интересах повышения безопасности гемотрансфузионной терапии ведущие центры крови, предприятия по производству препаратов крови России могут и должны внедрять генодиагностические технологии.

На главную